ප්රෝටීන් පිරිසිදු කිරීම සඳහා ක්රම

ජෛවතාක්ෂණික පර්යේෂණයෙහි වැදගත් අංගයක් වන්නේ නිශ්චිත කාර්මික යෙදුම් සඳහා ප්රශස්තිකරණ ගුණ සහිත ප්රෝටීන නිර්මාණය කිරීම හෝ වෙනස් කිරීම සඳහා ප්රෝටීන ඉංජිනේරු ශිල්ප ක්රම භාවිතා කිරීමයි. මේ සඳහා විද්යාඥයින්ට උනන්දුවක් දක්වන ප්රෝටීන් හුදකලා කිරීමට හා පිරිසිදු කිරීමට හැකි විය යුතුය. ඔවුන්ගේ ප්රතික්රියා, උපස්ථර විශේෂිතතා, අනෙකුත් ලයිගන් හා ප්රතික්රියා වල විශේෂිත ක්රියාකාරකම් අධ්යයනය කළ හැකිය.

අවශ්ය ප්රෝටීන් සංශුද්ධතා ප්රමාණය ප්රෝටීන සඳහා අපේක්ෂිත අවසන් භාවිතය මත රඳා පවතී.

සමහර යෙදීම් සඳහා බොරතෙල් සාරය ප්රමාණවත්ය. කෙසේ වෙතත්, ආහාර හා ඖෂධ වැනි අනෙකුත් භාවිත සඳහා, උසස් පිරිසිදු මට්ටමක් අවශ්ය වේ. මෙය සපුරා ගැනීම සඳහා ප්රෝටීන් පිරිසිදු කිරීමේ ක්රම කිහිපයකින් පිරිසිදු කිරීමේ පියවර මාලාවක් භාවිතා කරයි.

සෑම ප්රෝටීන පිරිසිදු කිරීමේ පියවරක් සාමාන්යයෙන් යම් නිෂ්පාදනයක් අලාභයක් සිදු කරයි. එබැවින් පරිපූර්ණ ප්රෝටීන් පිරිපහදු කිරීමේ උපායමාර්ගය වන්නේ පඩි පෙළේ ඉහළ මට්ටමේ පිරිසිදු කිරීමයි. භාවිතයට ගන්නා පියවරයන් තෝරාගැනීම ඉලක්කගත ප්රෝටීන් ප්රමාණය, ආරෝපණය, ද්රාව්යතාව හා වෙනත් ගුණ මත යැපේ. එක් සෛලොසොල් ප්රෝටීන් පිරිසිදු කිරීම සඳහා පහත සඳහන් තාක්ෂණික ක්රම වඩාත් සුදුසුය. සයිටොසොලික් ප්රෝටීන් සංකීර්ණ පිරිසිදු කිරීම වඩාත් සංකීර්ණ වන අතර සාමාන්යයෙන් විවිධ ක්රම භාවිතා කළ යුතුය.

ප්රෝටීන් පිරිපහදු කිරීම සඳහා පළමු පියවර

සෛලීය ප්රෝටීනින් පිරිසිදු කිරීමේ අභ්යන්තර කෙලවරේ පළමු පියවර වන්නේ බොරතෙල් සාරය සැකසීමයි .

මෙම සාරය සෛල සෛල සෛල සෛල සෛලයෙන් ලබා ගන්නා සංකීර්ණ මිශ්රණයක් සහ සමහර අතිරේක මැක්රෝමැලිකල්, කෝෆැක්ටෝ සහ පෝෂ්ය පදාර්ථ අඩංගු වේ. කෙසේවෙතත්, පිරිසිදු නිස්සාරකයක් ජෛවතාක්ෂණයේ සමහර යෙදීම් සඳහා යොදා ගත හැකි වුවද, පිරිසිදුකම ප්රශ්නයක් නම්, පසුව පවිත්ර කිරීමේ පියවර අනුගමනය කළ යුතුය.

රසායනික ද්රව්ය සහ එන්සයිම , හීලෑකරණය හෝ ප්රංශ මුද්රණාලය මගින් ලබා ගන්නා ලද සෛල ලියිසා මඟින් ජනනය වන සෛලීය සුන්බුන් ඉවත් කිරීමෙන් බොරු ප්රෝටීන් නිස්සාරක සකස් කරනු ලැබේ. මෙම සුන්බුන් කේන්ද්රගත කිරීමෙන් ඉවත් කරනු ලැබේ. සෛල ප්රසාරණය මගින් සරල සෛල ඉවත් කිරීමෙන් පිටත සෛල ප්රෝටීන නිපදවනු ලැබේ.

ඇතැම් ජෛව තාක්ෂණික යෙදුම් සඳහා, තාප ස්ථායී එන්සයිම සඳහා ඉල්ලුමක් පවතී: denaturing නොමැතිව ඉහළ උෂ්ණත්වයන් ඉවසා ගත හැකි එන්සයිම සහ ඉහළ නිශ්චිත ක්රියාකාරිත්වයක් පවත්වා ගෙන යාමේදී. ඒවා නිපදවන ජීවීන් අන්තෝනිෆිලි ලෙස හැඳින්වේ. තාපය-ප්රතිරෝධක ප්රෝටීන් පිරිසිදු කිරීම සඳහා පහසු ප්රවේශයක් නම්, උණුසුම මගින් සිසිල් කිරීම මගින් අනෙක් ප්රෝටීන ද්රාවණය කිරීම සඳහා අවශ්ය වේ නම්, එවිට තාපනය කළ හැකි එන්සයිම අවශෝෂණය කිරීම හෝ අවශ්ය නම් නැවත සංලක්ෂිත කිරීමට ඉඩ සලසනු ලැබේ.මැටීනිත ප්රෝටීන් කේන්ද්රාපසාරණය කිරීමෙන් ඉවත් කළ හැකිය.

අන්තර් ශෝධක පියවර

අතීතයේදී බොරතෙල්වලින් ප්රෝටීන් පිරිසිදු කිරීම සඳහා පොදු දෙවන පියවරක් වූයේ ඉහළ ඔක්ටෝටික් ශක්තිය (එනම්, ලුණු ද්රාවණ) සහිත ද්රාවණයකි. නයිට්රික් අම්ල, බොරතෙල් නිස්සාරකයක් ස්ට්රෝප්ටොමික්සීන් සල්ෆේට් හෝ ප්රටමින් සල්ෆේට් සමඟ පිහිටුවන ලද සමස්ථානික ක්ෂය වීමෙන් ඉවත් කළ හැකිය.

ප්රෝටීන් වර්ෂාපතනය සාමාන්යයෙන් ලුණු ලෙස ඇමෝනියම් සල්ෆේට් භාවිතා කරයි.

විවිධ ප්රෝටීන වල ඇමෝනියම් සල්ෆේට් සාන්ද්රණයන්හි විවිධ සාන්ද්රණයකින් නිපදවනු ඇත. සාමාන්යයෙන් ඉහළ අණුක ස්කන්ධයේ ප්රෝටීන ඇමෝනියම් සල්ෆේට් සාන්ද්රණය අඩු කරයි. ලුණු වර්ෂාපතනය සාමාන්යයෙන් ඉතා පිරිසිදු ප්රෝටීනයක් බවට පත් නොවී, මිශ්රණයක් තුළ සමහර අනවශ්ය ප්රෝටීන ඉවත් කිරීම සහ සාම්පල සාන්ද්රණය පිටුදැකීම සඳහා සහාය විය හැක. එවිට ද්රාවණය මඟින් දියරමය විසඳුමක් තුළ ලුණු ඉවත් කරනු ලැබේ.

නූතන ජෛව තාක්ෂණය යනු සාමාන්ය ක්රමවේදයන් සඳහා සූදානම් කළ විසඳුම් සපයා ඇති බොහෝ වාණිජමය කට්ටල ලබා ගැනීමයි. ප්රෝටීන් පිරිපහදු කිරීම බොහෝවිට පෙරහුරුවක සහ සකස් කරන ලද ජෙල් පෙරීමක තීරු භාවිතා කරයි. ඔබ විසින් කළ යුතු සියල්ල, උපදෙස් අනුගමනය කර නිවැරදිව විසඳුමේ නිවැරදි පරිමාව එක් කිරීම හා අලුත් පරික්ෂක නළය තුළ තීව්රක එකතු කිරීම (තීරුවේ අන්තිම කෙළවරේ) එකතු කරන අතර නියමිත වේලාවටම රැඳී සිටින්න.

• බ්ච්ච්-ඉහළ තීරු හෝ ස්වයංක්රීය HPLC උපකරණ භාවිතයෙන් ක්රෝමියම්කරණ ක්රම යොදා ගත හැකිය. HPLC මගින් වෙන් කිරීම ප්රතිවිරුද්ධ කලාපය, අයන හුවමාරුව හෝ ප්රමාණ-බැහැර කිරීමේ ක්රම මගින් සිදු කළ හැකි අතර ඩයෝඩ ලේසර් හෝ ලේසර් තාක්ෂණය මගින් හඳුනාගෙන ඇති නියැදි භාවිතා කළ හැක. -

  පවිත්රකරණය පිළිබඳ ප්රෝටීන් දර්ශනය හා තක්සේරු කිරීම

  • ප්රතිවිරුද්ධ අවධි වර්ණාලේපනය (RPC) ඔවුන්ගේ සාපේක්ෂ ජලෞඛ්ය චාලක මත පදනම්ව ප්රෝටීන වෙන් කරයි. මෙම ක්රමවේදය බෙහෙවින් වරණාත්මක වන නමුත් කාබනික ද්රාවක වර්ග භාවිතා කිරීම අවශ්ය වේ. සමහර ප්රෝටීන් නිශ්පාදිත ද්රාවණින් ස්ථීරවම අගය කරන අතර RPC වල ක්රියාකාරිත්වය අහිමි වනු ඇත. එබැවින් මෙම ක්රියාවලිය සියලුම යෙදුම් සඳහා නිර්දේශ කරනු නොලැබේ. විශේෂයෙන් ඉලක්කගත ප්රෝටීනය සඳහා ක්රියාකාරිත්වය රඳවා ගැනීම අවශ්ය වේ.
  • Ion-exchange chromatography යනු ආරෝපිත මත පදනම් වූ ප්රෝටීන වෙන් කිරීමයි. ඇන්ටන් හුවමාරුව හෝ කැටායන හුවමාරුව සඳහා එක්කෝ සකස් කළ හැක. ඇනීන හුවමාරු තීරු, සෘණ ආරෝපිත ප්රෝටීන වලට ආකර්ෂණය වන ධන ආරෝපනයක් සහිත ලිපි ද්රව්යය වේ. කැටායන හුවමාරු තීරු යනු ධනාත්මක ආරෝපිත ප්රෝටීන් ආකර්ෂණය කරන නිෂේධනීය, සෘණ ආරෝපිත මිරිකා. ඉලක්ක කරන ප්රෝටීනය (elimination) නම් කිරණ සිදුකරනු ලබන්නේ තීරයේ pH අගය වෙනස් වීමෙනි. එක් ප්රෝටීන් වල ආරෝපිත ක්රියාකාරී කාණ්ඩවල වෙනසක් හෝ උදාසීන කිරීමක් සිදු කරයි.
  • විශාල-අක්රමාංකිත වර්ණාලේපනය ( ජෙල් ෆිල්ටර්රේෂණය ) කුඩා අණු වලින් විශාල ප්රෝටීන වෙන් කරනු ලැබේ. විශාල අණු වේගයෙන් ගමන් කරයි. විශාල ප්රෝටීන පොලිම් වල ඇති දියර තුලට නොගැලපෙන අතර කුඩා ප්රෝටීන සෑදීමේදී, ඒවායේ අඩු සෘජු මාර්ග හරහා චුම්බක ශිල්පීය තීරුව හරහා ගමන් කිරීමට වැඩි කාලයක් ගතවේ. ප්රෝටීන බෙදීම් මත පදනම් වූ ප්රෝටීන වෙන් කරන ලද නාලිකා මාලාවක් තුලදී එලියට් එකතු කෙරේ. ජාන පෙරීම යනු ප්රෝටීන සාම්පලයක් සාන්ද්රණය කිරීම සඳහා ප්රයෝජනවත් ආයුධයකි. මුල් ප්රෝටීනයට එකතු කරන ලද කුඩා පරිමාණයෙන් ප්රෝටීන පරිමාව ප්රෝටීන එකතු කරනු ලැබේ. සමාන පිරිවිතරකරණ තාක්ෂණයන් විශාල පරිමාණ ප්රෝටීන නිෂ්පාදනය කිරීමේදී ඒවායේ පිරිවැය-ඵලදායීතාවය නිසා භාවිතා විය හැකිය.
  • ප්රශස්ත වර්ණ ඡායාරූපකරණය ප්රෝටීන පිරිසිදු කිරීමේ ක්රියාවලිය සම්පුර්ණ කිරීම හෝ ප්රචලිත කිරීම සඳහා ඉතා ප්රයෝජනවත් තාක්ෂණයකි. වර්ණ ඡායාරූපයේ තීරුවේ ඇති බිත්තිවල ඉලක්කය ප්රෝටීනට විශේෂයෙන් බන්ධනය වන ලිංගාඩ් වලට එකිනෙකට සම්බන්ධ වී ඇත. නිදහස් ප්රෝටීන අඩංගු විසඳුමක් සමඟ ප්රෝටීන් ඉවත් කිරීමෙන් තීරු වලින් ඉවත් කෙරේ. මෙම ක්රමය වඩාත් පිරිසිදු ප්රතිඵල හා වෙනත් තාක්ෂණික ක්රම වලට සාපේක්ෂව ඉහළම නිශ්චිත ක්රියාකාරිත්වය ලබා දෙයි.
• SDS-PAGE යනු ෙපොලි සක්රියයිමයිඩ් ෙජල් ඉලෙක්ට්රෝෙටෝෙපෝෙසසිස් (SDS) (සෝඩියම් ඩීඩෙකයිල් සල්ෆේට්) සංෙයෝජිත ෙකෙරහි විශාල ශුද්ධ ඍණ ආරෝපණයක් ලබා ෙදයි. සියලු ප්රෝටීනවල ආරෝපණ තරමක් සමාන වන බැවින් මෙම ක්රමය සම්පූර්ණයෙන්ම පාහේ මත පදනම් වේ. එක් එක් පියවරෙන් පසු ප්රෝටීන් පරිණාමය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා SDS-PAGE බොහෝ විට යොදා ගනී. අනවශ්ය ප්රෝටීන මිශ්රණයෙන් ක්රමයෙන් ඉවත් කර ඇති නිසා, SDS-PAGE ජෙලි මත දර්ශනය කරන ලද බ්ලොක් ප්රමාණය අඩු කරනු ලැබේ.
• Immunoblotting යනු අනුප්රාප්තික වර්ණාලේපනය සමඟ සංෙයෝජිත කරන ලද ප්රෝටීනයිත දෘශ්ය ක්රමයකි. නිශ්චිත ප්රෝටීන සඳහා ප්රතිජීවක උත්පාදක වාෂ්ප ශිෂේණ තීරුවක ලයිගන් ලෙස භාවිතා කෙරේ. ඉලක්ක ප්රෝටීනය තීරු මත රදවා තබා ඉන්පසු ලුණු ද්රාවණය හෝ වෙනත් නියෝජිතයන් සමග තීරු සේදීම මගින් ඉවත් කරනු ලැබේ. මිශ්රණයේ සෙසු කොටස් වලින් වෙන් වූ පසු ඉලක්ක කරන ප්රෝටීන හඳුනා ගැනීම සඳහා විකිරණශීලී හෝ සායම් ලේබල් සම්බන්ධ කර ඇති ප්රතිදේහ.

මූලාශ්ර:

Zubay G. 1988. ජෛව රසායනය, 2 වන සංස්කරණය. මැක්මිලන් පබ්ලිෂින් කම්පැණි, නිව් යෝර්ක්, නිව්, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය.

අමර්ස්හැම් ෆාමසියි බයෝටෙක්. 1999. Protein Purification Handbook, සංස්කරණය AB. අමර්ස්හැම් ෆාමාඒෂියා බයෝටෙක් ඉන්කෝපරේෂන් නිව් ජර්සි, ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.