DNA අණුව හා ජාන වැඩි දියුණු කිරීම සඳහා PCR විසින් කළයුතු කුමක්ද?
පොලිමරේස් දාම ප්රතික්රියාව ( PCR ) ජානයක බහු පිටපත් සෑදීම සඳහා අණුක ජානමය තාක්ෂණයක් වන අතර ජාන අනුක්රමික ක්රියාවලියේ කොටසක්ද වේ.
පොලිමදාසයේ දාම ප්රතික්රියා ක්රියා කරන්නේ කෙසේද?
ජාන පිටපත් සෑදී ඇත්තේ DNA නියැදියකින් වන අතර, නියැදියක ඇති එක් ජානයකින් එක් පිටපතක් පිටපත් කිරීම සඳහා ප්රමාණවත් තරම් තාක්ෂණය භාවිතා වේ. පිටපත් මිලියන ගණනක් සෑදීම සඳහා ජාන විකෘත කිරීම, DNA අණුවක විශාලත්වය සහ ආරෝපණ (+ හෝ -) මත පදනම් වූ දෘශ්ය තාක්ෂණික ක්රම භාවිතා කරමින් ජාන අනුපිළිවෙල හඳුනාගැනීම සහ හඳුනා ගැනීම සඳහා ඉඩ ලබා දේ.
පාලිත තත්වයන් යටතේ, DNA වල කුඩා කොටස් (DNA segments) මගින් DNA පොලිමාණයන් ලෙස හඳුන්වන එන්සයිම මගින් නිපදවන ඩොක්සීනේටෝටයිටිස් (dNTPs) ඩීඑන්එන්එස් (DNA) ලෙස හැඳින්වේ. පොලිමරේස් සඳහා ආරම්භක ලක්ෂ්යයක් ලෙස "ප්රෝටස්" යනුවෙන් හැඳින්වෙන DNA කැබලි පවා කුඩා වේ. උදාසීන නම්, DNA අණුවක (ඔලගුසර්) කුඩා මිනිසා සාදන ලද කෑලි, සාමාන්යයෙන් නියුක්ලියෝටයිඩ 15 සිට 30 දක්වා දිගු වේ. ඒවා ජාන මඟින් කෙටි ජාන අනුක්රමය දැන ගැනීම හෝ උපකල්පනය කිරීමෙන් ජාන මාංශයේ ඇති කෙළවරේ දී ඇති වේ. PCR වලදී DNA අනුසාරයෙන් රත් වන අතර ද්විත්ව නල වෙන් වෙන් වේ. සිසිලනය කිරීමෙන් පසු, නියැදි ආකෘතියට (ආදේශ කිරීම ලෙස හැඳින්වේ) සහ පොලිමරේස් සඳහා ස්ථානයක් නිර්මාණය කිරීම.
PCR තාක්ෂණය
තාපයෝගයන් හා තාපජිෆෝරියා පොලිමරේස් එන්සයිම් සොයා ගැනීමෙන් (පොලිමානයි දාම ප්රතික්රියාව (PCR)) මගින් (උෂ්ණත්වයේ දී තාපයෙන් පසු උෂ්ණත්වය හා ව්යුහීය අඛණ්ඩතාව හා ක්රියාකාරීත්වය පවත්වා ගෙන යන එන්සයිම) මගින් සිදු කෙරේ.
PCR තාක්ෂණයට අදාල පියවර පහත පරිදි වේ:
- DNA මිශ්රණය, පොලිමරේස් එන්සයිම, පොල්පර සහ ඩීඑන්ටීඑස් වර්ගවල ප්රශස්තක සාන්ද්රණය සමඟ මිශ්රණයක් නිර්මාණය වේ. එන්සයිම denaturing තොරව තාපය තාපනය කිරීමේ හැකියාව සෙල්සියස් අංශක 94 ක පරාසයේ උෂ්ණත්වයේ දී ඩීඑන්එස් සාම්පල ද්විත්ව හෙලික්ස් denaturing කිරීම සඳහා ඉඩ ලබා දේ.
- පහත සඳහන් denatureuration මගින් නියැදිය පොදුවේ මධ්යස්ථ පරාසයක් දක්වා සිසිල් කරනු ලැබේ. ඒවායේ අංශක 54 ක් පමණ වන අතර, එක් එක් පේළියක DNA ආකෘති වලට මුල්ම පාෂාණ (ආදේශ කිරීම) පහසු කරයි.
- චක්රයේ තෙවන පියවරේදී, නියැදි උෂ්ණත්වය 72 ක් දක්වා උෂ්ණත්වය ඉහළ යාම සඳහා Taq DNA DNA පොලිමරේස් සඳහා උචිත උෂ්ණත්වය වේ. දිගු කිරීමේදී ඩීඑන්ඒ පොලිමරේස් එක් එක් පොටෑසියම් 3 'අවසානයන්ට අනුපූරක dNTP එකතු කිරීම සඳහා ආකෘතියක් ලෙස ඩීඑන්ඒ ඩීඑන්ඒ මූලද්රව්ය භාවිතා කරනු ලබයි. උනන්දුව ඇති ජාන කලාපයේ ද්විත්ව දිරාපත් කරන ලද DNA ආදිය සාදයි.
- නිශ්චිත ගැලපුමක් නොවන DNA අනුපිළිවෙලවල් අවුස්සන ලද උදාසීන, අංශක 72 කදී නොපවතින අතර, එමගින් පොලියෙහි ප්රසාරණය වීම සීමා වී ඇත.
මිශ්රණය, විසුරුවා හැරීම හා දිගු කිරීම මෙම ක්රියාවලිය බහු (30-40) ගුණයක් නැවත නැවතත්, එමගින් මිශ්රණයේ අපේක්ෂිත ජාන පිටපත් ගණන exponentially. මෙම ක්රියාවලිය අතින් අතින් සිදු කළ හැකි වුවද සාම්පල සාදා ගත හැකි අතර බොහෝ අණුක රසායනාගාරවල දැන් බහුලව භාවිතා වන ක්රියාකාරී Thermocycler තුලට සකසා ගත හැකි අතර, සම්පූර්ණ PCR ප්රතික්රියාව පැය 3-4 කින් සිදු කළ හැකිය.
සෑම denaturing පියවර පූර්ව චක්රයේ දිශාගත කිරීමේ ක්රියාවලිය නතර කරයි. එමගින් DNA අණුව නවතාලමින් හා අපේක්ෂිත ජාන ප්රමාණයට ආසන්නව තබා ගැනීම.
දිගු චක්රයේ කාලසීමාව උනන්දුවක් දක්වන ජාන ප්රමාණය මත දිගු කිරීම හෝ කෙටි කිරීම සිදු කළ හැකි නමුත්, අවසානයේදී, PCR වල නැවත නැවත චලනයන් මගින්, බහුතරයේ ආකෘති පමණක් පොලියට පමණක් සීමා වන ප්රමාණයට සීමා වනු ඇත. මැලියම් වර්ග දෙකෙන් නිපදවනු ලැබේ.
සාර්ථක ප්රතිඵල ලබා ගැනීම සඳහා විවිධ සාධක කිහිපයක් තිබේ. PCR නිශ්පාදනය සඳහා පරීක්ෂා කිරීම සඳහා වඩාත් පුළුල් ලෙස භාවිත කරන ක්රමය වන්නේ agarose gel electrophoresis වේ. ප්රමාණය හා ආරෝපණය මත DNA කොටස් වෙන් කිරීම සඳහා භාවිතා කරනු ලැබේ. මෙම කැබලි මඟින් ඩයි වර්ග හෝ විකිරණශීලී සමස්ථානික භාවිතා කරනු ලැබේ.
පරිණාමය
PCR සොයාගැනීමත් සමඟම මුල් ටාක් හැර DNA DNA පොලිමරේස් සොයාගෙන ඇත. මේවායින් සමහරක් වඩා හොඳ "සෝඩෙක්ටර්ස්" හැකියාව හෝ ඉහළ උෂ්ණත්වවලදී වඩා ස්ථායී වේ. එබැවින් PCR වල නිශ්චිතභාවය වැඩිදියුණු කිරීම සහ වැරද dNTP ඇතුළත් කිරීමේදී දෝෂ අවම කිරීම.
PCR වල ඇතැම් ප්රභේදයන් නිශ්චිත යෙදුම් සඳහා නිර්මාණය කර ඇති අතර අණුක ජාන විද්යාගාරවල නිතිපතා භාවිතා කරනු ලැබේ. මේවායින් සමහරක් Real-Time PCR සහ ප්රතිවර්ති පිටපත PCR. PCR සොයාගැනීම ද DNA අනුකමණය, DNA ඇඟිලි සලකුණු සහ වෙනත් අණුක තාක්ෂණ ක්රම දියුණු කිරීමට හේතු වේ.